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Découvrez comment produire, dans son laboratoire, des Géloses MSRV

Domaine d’application des géloses MSRV

La gélose de Rappaport-Vassiliadis semi-solide modifiée (MSRV) est un milieu sélectif, utilisé pour l’isolement des Salmonelles mobiles. Il n’est pas adapté à la détection des salmonelles non-mobiles (Salmonella Gallinarum et Pullorum).

Développée par De Smedt et al, la composition du milieu dérive de celle du bouillon de Rappaport-Vassiliadis (RV) utilisé pour l’enrichissement sélectif des salmonelles dans les denrées alimentaires. Celui-ci a subi deux modifications pour devenir la gélose de Rappaport-Vassiliadis semi-solide modifiée (MSRV) :

– Une adjonction d’une faible quantité d’agar pour la texture semi-solide nécessaire à l’appréciation de la mobilité des salmonelles recherchées.

– Un réajustement de sa sélectivité par un abaissement du taux de chlorure de magnésium présent et l’ajout de Novobiocine à hauteur de 10 mg/L.

La gélose MSRV (ISO 6579-1 : 2017) entre dans le protocole de recherche des salmonelles dans le cadre des prélèvements réalisés dans l’environnement (matières fécales animales et échantillons environnementaux) des filières de production animale (élevages, couvoirs), ainsi que dans celui de la mise en évidence des salmonelles chez les oiseaux (œufs à couver, prélèvements d’organes) et chez les mammifères.

Principe de fonctionnement des géloses MSRV

– L’efficacité bactériologique est fondée sur la capacité des salmonelles à migrer de façon sélective dans le milieu.

– Les bactéries contaminantes sont inhibées par la forte concentration en chlorure de magnésium, ainsi que par la présence de vert malachite.

– La Novobiocine permet d’inhiber la plupart des microorganismes à Gram positif et d’éviter le développement des Proteus.

– Les Salmonelles produisent un halo opaque, témoin de la culture.

– Si la présence de telles salmonelles est suspectée, les cultures obtenues sur le milieu de pré enrichissement doivent être repiquées sur les milieux appropriés, en suivant les procédures adaptées.

Formule-type des géloses MSRV

La composition peut changer sensiblement selon le fournisseur.

Pour 1 litre de milieu :

– Digestat enzymatique de tissus animaux et végétaux……………….4,59 g

– Hydrolysat acide de caséine………………………………………………….4,59 g

– Chlorure de sodium ……………………………………………………………..7,34 g

– Phosphate monopotassique …………………………………………………. 1,47 g

– Chlorure de magnésium anhydre …………………………………………10,93 g

– Vert malachite (oxalate)……………………………………………………..37,0 mg

– Agar agar bactériologique……………………………………………………..2,70 g

Préparation du milieu de culture MSRV

Du fait de sa composition, semi-solide, il est très compliqué de transporter le milieu MSRV. C’est pour cette raison que la plupart des fabricants le proposent principalement en poudre. Il faut donc la mélanger avec de l’eau, puis stériliser et couler dans des boites de Pétri sur le lieu d’usage. Dans cet article, nous nous sommes intéressés à la préparation de ce milieu pour lequel il faut prendre quelques précautions.

<< Deux de nos clients prestataires de microbiologie dans le domaine de l’agroalimentaire nous ont livré leurs protocoles de préparation. >>

Le premier laboratoire de microbiologie alimentaire, prépare son milieu MSRV à la casserole. Sur des volumes de deux litres. De la même manière que pour le précédent, il s’agit de mettre en suspension cette fois-ci 63,2 g de milieu déshydraté dans 2 litres d’eau déminéralisée. Le mélange est porté à ébullition et y est maintenu pendant quelques minutes jusqu’à sa dissolution sous agitation constante. Le refroidissement se fait ensuite à température ambiante. L’ajout de Novobiocine se fait juste avant le coulage des boites à une température de 45°C en incorporant 20 mg de Novobiocine reconstitués avec 10 ml d’eau stérile.  Le temps de prise en masse est d’environ 2h00.

Géloses MSRV casserole

Notre deuxième laboratoire de microbiologie alimentaire prépare son milieu MSRV en préparateur de milieu sur des volumes de 10L. Il s’agit donc de mettre en suspension 316 g de milieu déshydraté dans 10 litres d’eau déminéralisée. L’homogénéisation s’amorce alors par un système d’agitation des pales de l’auto-préparateur accompagnée par une montée en température. Le palier de stérilisation est une étape cruciale en raison de la sensibilité de ce milieu à des températures trop élevées (>100°C). Celle-ci doit donc atteindre son point maximal à 98°C pendant une minute avant de passer à l’étape de refroidissement à 44-45°C. L’ajout de Novobiocine s’opère au moment de la distribution en incorporant stérilement 100 mg de Novobiocine reconstituée avec 50 ml d’eau stérile dans le préparateur de milieu toujours sous agitation.  La distribution se fait ensuite via un distributeur de milieu de culture, qui va remplir automatiquement et aseptiquement des boites de Pétri en plastique.

Points importants à prendre en compte :

– Le temps de prise en masse est plus long que pour la plupart des milieux de culture ; il se situe entre 30 min et 1 heure.

– Un chauffage trop important ou pas assez important du milieu MSRV peut induire des faux positifs.

– Les boites coulées avec supplément peuvent être stockées pendant 15 jours à une température de 2-8°C à l’abri de la lumière.

L’utilisation d’un préparateur de milieu et d’un distributeur de milieu peut donc faciliter la maîtrise de la température mais permet également un gain de temps et la possibilité de préparer de plus gros volumes de milieu.

Ensemencement des boites de Pétri MSRV

– Ensemencer trois gouttes (environ 0,1 ml) de la culture provenant d’un milieu de pré enrichissement, au centre d’une boîte de milieu.

– Incuber à (41,5 ± 1,0) °C, pendant (24 ± 3) heures, sans retourner les boîtes. Au constat de l’absence de migration en 24 heures, l’incubation sera prolongée de (24 ± 3) heures supplémentaires.

La température d’incubation ne devra jamais être supérieure à 43°C.

Boite de Pétri avec du milieu MSRV distribué via un distributeur de milieu de culture : 

Géloses MSRV ABE
 

Lecture des boites MSRV

Après la période d’incubation, les microorganismes mobiles développent un halo de croissance blanc opaque depuis le point d’inoculation.

La confirmation et l’identification sont ensuite opérées par des tests biochimiques et sérologiques en prélevant deux colonies caractéristiques isolées.

Salmonella Typhimurium sur MSRV. Les zones opaques couvrent presque tout le milieu :

Géloses MSRV
 
catalogue alliance bio expertise
 

Références bibliographiques

De SMEDT, J.M., BOLDERDIJK, R.F., RAPPOLD, H. and LAUTENSCHLAEGER, D.. 1986. Rapid Salmonella detection in foods by motility enrichment on a Modified Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis medium. Journal of Food Protection, 49 : 510-514.
-De SMEDT, J.M. and BOLDERDIJK, R.F..1987. Dynamics of Salmonella isolation with Modified Semi-Solid Rappaport – Vassiliadis medium. Journal of Food Protection, 50 : 658-661.
-BOLDERDIJK, R.F. and MILAS, J.E..1996. Salmonella detection in dried milk products by motility enrichment on modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium: collaborative study. Journal of AOAC International, 79 : 441-450.
-ISO 6579-1 :2017 Microbiologie de la chaine alimentaire-Méthode horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonelle—partie 1 : Recherche de Salmonella spp.
-NF U 47-100. Juillet 2007. Méthodes d’analyse en santé animale. Recherche par l’isolement et identification de tout sérovar ou de sérovar(s) spécifié(s) de salmonelles dans l’environnement des productions animales.
-NF U 47-101. Novembre 2007. Méthodes d’analyse en santé animale. Isolement et identification de tout sérovar ou de sérovar(s) spécifié(s) de salmonelles chez les oiseaux.
-NF U 47-102. Janvier 2008. Méthodes d’analyse en santé animale. Isolement et identification de tout sérovar ou de sérovar(s) spécifié(s) de salmonelles chez les mammifères.
-NF EN ISO 6579/A1 (V 08-013/A1). Janvier 2008. Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.. Amendement 1 Annexe D : recherche de Salmonella spp. Dans les matières fécales des animaux et dans des échantillons au stade de la production primaire.

 


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