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Fabrication des diluants : Eau peptonée tamponnée et bouillon de Fraser

Do it yourself!

L’eau peptonée tamponnée et le bouillon de Fraser sont des diluants couramment utilisés lors de la préparation d’échantillons de produits alimentaires ou lors de contrôles environnementaux.

L’EPT est utilisée comme diluant pour le dénombrement des microorganismes dont Listeria monocytogenes et comme milieu de pré-enrichissement non sélectif pour la recherche de Salmonelles dans les produits alimentaires ou les échantillons environnementaux.

Le bouillon de Fraser quant à lui est recommandé pour l’enrichissement sélectif et différentiel de Listeria monocytogenes dans les produits alimentaires et notamment dans le lait et les produits laitiers (4).

Si l’utilisation de l’EPT et du bouillon de Fraser est largement sollicitée en laboratoire de contrôle qualité microbiologique, deux approches se discutent dans la gestion de ces grands volumes de diluants : Acheter du prêt à l’emploi conditionné en poches, flacons ou en tubes ou fabriquer soi même les diluants, en autoclave ou en autopréparateur de milieux.

Nous allons tenter dans cet article de mettre la lumière sur cette fabrication « Maison » de l’EPT et du bouillon de Fraser de plus en plus courante en laboratoire, souvent pour une question de coût mais pas que.

Fabriquer son propre bouillon Fraser ou son eau peptonée tamponnée

Mais d’abord, comment fabrique-t-on ces diluants ?

On y trouve de la souplesse dans l’autonomie :

Fabriquer ses diluants soit même permet d’ajuster les quantités fabriquées à l’activité du laboratoire pas toujours prévisible, cela évite les pertes ou les urgences d’approvisionnement en cas d’une augmentation inattendue du nombre d’échantillons. Utiliser un autopréparateur de milieux permet d’autant plus cette flexibilité grâce à la possibilité de préparer entre 3L et 30 L de diluant selon les besoins du laboratoire.

Les tubes, flacons et poches de bouillon prêt à l’emploi se stockent à une température entre 2 et 25°C quand les bases déshydratées, elles, se stockent à des températures entre 2 et 30°C. Ces petits 5 degrés de différence peuvent être à l’origine de grands désagréments si des couacs de maitrise des températures se produisent et cela arrive malheureusement …

Que dit la norme (ISO 11133-2014)?

Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production, stockage et essais de performance des milieux de culture

Que dit la norme (ISO 7218-2007)?

Microbiologie des aliments pour la consommation humaine et l’alimentation animale. Les conditions générales requises et le guide pour l’examen microbiologique .

La validation initiale devrait couvrir l’étude de la performance de chaque cycle et de chaque volume moyen utilisé dans la routine. Ces étapes doivent être répétées après chaque modification ou réparation majeure. Deux sondes de température, l’une près de l’autre sonde de contrôle avec la distance au premier peut être employée pour démontrer l’uniformité de la température.

La température et la durée de chaque cycle doivent être enregistrées et surveillées.

Points critiques dans la préparation des diluants:

Autopréparateur VS Autoclave :

À la vue des points critiques qui jonchent la préparation des diluants, l’utilisation d’un autopréparateur semble naturellement plus adéquat que l’utilisation de l’autoclave à fortiori pour de grands volumes et ce pour différentes raisons :

La maîtrise de la température : pour rappel et selon l’ISO, l’autoclave a une variation de +/- 3°C minimum et est plus lent au refroidissement (45min) alors que l’autopréparateur est à une variation de +/- 0.5°C et est plus rapide pour refroidir (15-20min), ce qui permet d’éviter toutes les problématique de stérilité et de fertilité.

La maîtrise de l’homogénéité: agitation automatique assurée par les pales de l’autopréparateur assure un brassage optimal réglable selon le type de bouillon que l’on souhaite fabriquer.

La sonde permet quant à elle de maîtriser la température dans le diluant de façon continue.

Les additifs: L’ajout maîtrisé et en toute sécurité des additifs dans un autopréparateur.

Les tests de fertilité et de stérilité:

Selon la norme ISO 11133 chaque lot de diluant fabriqué doit être soumis à des tests de fertilité et de stérilité.

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BIBLIOGRAPHIE

ISO 6579.

Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.

ISO 6785.

Lait et produits laitiers – Recherche de Salmonella spp.

ISO 6887-1.

Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 1 : règles générales pour la préparation de la suspension mère et des dilutions décimales.

ISO 6887-2.

Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 2 : règles spécifiques pour la préparation des viandes et produits à base de viande.

ISO 6887-4.

Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 4 : règles spécifiques pour la préparation de produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche.

ISO 6887-5.

Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 5 : règles spécifiques pour la préparation du lait et des produits laitiers.

ISO 6887-6.

Microbiologie des aliments – Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique – Partie 6 : règles spécifiques pour la préparation des échantillons prélevés à l’étape de production primaire.

ISO 19250.

Qualité de l’eau. Dosage d’espèces de Salmonella

DONNELLY, C.W., and BAIGENT, G.J.. 1986.

Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk.

Applied and Environmental Microbiology, 52 : 689-695.

FRASER, J.A., and SPERBER, W.H.. 1988. Rapid detection of Listeria spp. in food and environmental samples by esculin hydrolysis. Journal of Food Protection, 51 : 762-765.

NF EN ISO 11290-1 (V 08-028-1). Février 1997.

Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1 : Méthode de recherche.

XP CEN ISO/TS 11133-2 (V 08-104-2). Janvier 2004.

Microbiologie des aliments. Guide pour la préparation et la production des milieux de culture. Partie 2 : Guide général pour les essais de performance des milieux de culture.

NF EN ISO 11290-1/A1 (V 08-028-1/A1). Février 2005.

Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1 : Méthode de recherche. Amendement 1 : Modification des milieux d’isolement, de la recherche de l’hémolyse et introduction de données de fidélité.

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